很多老師使用瑞士insphero 的3D懸滴培養(yǎng)板獲得3D微組織后，要提取RNA進(jìn)行熒光定量PCR。下面這篇文章就是介紹如何提取insphero 3D微組織中的RNA:

使用Promega ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System提取三維（3D）微組織的RNA

Introduction介紹

基于細(xì)胞的藥物開發(fā)和毒理學(xué)的多項分析，從培養(yǎng)細(xì)胞中提取高質(zhì)量的RNA是非常重要的。一些應(yīng)用如實時熒光定量PCR或微陣列分析的前提都是需RNA提取步驟。下面介紹的是從很小的微組織（約1000個細(xì)胞）中提取總RNA的protocol(ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System, promega)。

若想使用自動化RNA提取方法：可使用Promega的Maxwell 16 System。

Summary概述

從3D Insight 人肝臟微組織中提取RNA（ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System）。提取的RNA樣本用QuantiFluor RNA system，Agilent 2100 Bioanalyzer，GoTaq 1-Step RT-qPCR System進(jìn)行分析。

Materials材料

3D Insight Microtissues in GravityTRAP（Insphero）
1×PBS，含鈣離子和鎂離子
ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System（Promega Z6110）
Quantus Fluorometer（Promega E6150）
QuantiFluor RNA system(Promega E3310)

Procedure操作流程

一、微組織的準(zhǔn)備

1.輕柔的吸除GraityTRAP板中的培養(yǎng)基，用70ul的1×PBS洗滌微組織2次，如下圖Figure 1:

Figure 1: Pipette tip positioning during aspiration and addition of PBS

注：輕柔、緩慢洗滌微組織（<30ul/秒）

2.轉(zhuǎn)移微組織，1000ul吸頭垂直覆蓋GraityTRAP板孔的底端，吸頭要與孔底部緊密接觸，如Figure 2，將微組織吸出（約50ul）轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，避免吸入氣泡（避免微組織損失）。

Figure 2: Microtissue harvest from GravityTRAP plate using a 1000ul pipette tip

3. 4000g離心1min，去除PBS，直接作為RNA提取的樣本

二、RNA提取—ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System

1.直接加250ul LBA+TG buffer到樣本中

2.漩渦震蕩10秒，用吸頭吹打10次，裂解微組織。如想更*裂解，可使用掌上均質(zhì)器5-10秒

3.再加85ul的isopropanol(異丙醇)，漩渦震蕩5秒混合均勻

4.再參照ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System的手冊進(jìn)行結(jié)合和洗脫等步驟

5.用30ul水洗提RNA后，冰上放置

6.RNA濃度和產(chǎn)量用QuantiFluor RNA system和Quantus Fluorometer檢測

Typical Results結(jié)果

使用ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System提取3D InSight人肝臟微組織中的RNA，結(jié)果見Figure 3.

Figure 3：A-RNAs were isolated from either 1，2，4，or 8 microtissues. Yields were determined using the QuantiFluor RNA system with the Quantus Fluorometer and the RNA 6000 Pico kit. All values are greater than 9 indicating high quality RNA. 

B-HPRT specific primers were used with the GoTaq 1-Step RT-qPCR System to show amplifiability of the isolated RNAs.

C-RNAs were isolated from single microtissues to compare the average yield from one microtissue using this purification system.The line represents the average yield(n=6).

原文章鏈接：

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Insphero 三維細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品鏈接：

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